DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO ABO. 27/4/15

INTRODUCCIÓN

La clasificación correcta del grupo sanguíneo en la sangre del donante y del receptor es un paso fundamental en el acto transfusional. Para ello, es imprescindible confirmar el resultado de la prueba celular con la determinación sérica del grupo sanguíneo. En el caso de que no se disponga de suero para realizar esta prueba, se recomienda que otro técnico compruebe el resultado de la determinación celular.

Fundamento

El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes- Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.

Esta técnica puede realizarse tanto en porta como en tubo, aunque ser prefiere la determinación en tubo porque la centrifugación de los hematíes intensifica el fenómeno de aglutinación.

Material necesario

• Tubos de centrifuga.
• Pipetas Pasteur.
• Baño de agua.
• Centrifuga.
• Reloj.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.

Reactivos

• Hematíes del grupo A1.
• Hematíes del grupo A2.
• Hematíes del grupo B.
• Hematíes del grupo 0.
• Hematíes de la sangre problema.

Muestra

• Suero obtenido mediante coagulación de la sangre en baño de agua a 37°C durante 20 a 30 minutos.

Posteriormente centrifugamos durante 10 minutos a 3.000 r.p.m y extraemos el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur.

Técnica

1. Para evitar falsos negativos por la presencia de complemento activo en el suero, es aconsejable la inactivación previa de la muestra. Esto se realiza manteniendo el suero en un baño de agua a 56°C durante 10 minutos. Con esto evitamos los fenómenos de hemólisis debidos al complemento.
2. Lavamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con solución salina isotónica según la técnica descrita en la práctica XVIII. Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5% en solución salina.
3. Rotulamos un tubo de centrífuga con la letra A1, otro con la letra A2, otro B, otro 0 y otro C.
4. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado.
5. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado. En el tubo C añadimos una gota de la suspensión de los hematíes propis de la sangre problema, ya que nos servirá de control negativo.
6. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1.000 r.p.m durante 1 minuto.

Lectura de resultados

Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático.

Si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro indica que existe aglutinación. En el caso contrario, los hematíes se resuspenden homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

El grupo eritrocitario que se asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el siguiente cuadro:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	Ac presentes en el suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti-B	A1
- o +*	-	+	-	-	Anti-B y anti-A1*	A2
+	+	-	-	-	Anti-A	B
+	+	+	-	-	Anti-A y anti-B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
- o +*	-	-	-	-	Ninguno o Anti-A1	A2B
+	+	+	+	+	Autoanticuerpos	Ininterpretable

+ = Aglutinación

˗ = No aglutinación

* = Este anti-A1 se encuentra sólo en un 2% de los individuos A2.

Ó = Este resultado se observa sólo en el 25% de los individuos A2B.

Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacidos, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aún. También encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia, ya que carecen de anticuerpos, y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecíficos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo AB0.

Discrepancias entre la prueba celular y la sérica

En el caso de no obtener el mismo resultado en ambas pruebas debemos proceder de la siguiente manera:

1. Repetir ambas pruebas.
2. En el caso de persistir la discrepancia, so obtendrá una nueva muestra de sangre y se realizarán ambas pruebas utilizando hematíes lavados y resuspendidos correctamente a la concentración óptima de cada técnica.
3. Efectuar una prueba de Coombs directo sobre los hematíes para detectar posibles Autoanticuerpos.
4. Realizar la prueba sérica utilizando un panel de screening con hematíes A1, A2, B, 0.

Causas del a discrepancia entre la prueba celular y sérica

Las causas más frecuentes obedecen a tres tipos distintos:

1. Errores técnicos:

• Identificación incorrecta de las muestras o anotación de los resultados.
• No añadir todos los reactivos y muestras correspondientes.
• Contaminación de los reactivos o hematíes del panel de screening.
• Proporción inadecuada de muestra y reactivos.
• Sobrecentrifugación o centrifugación insuficiente.
• No valorar la hemólisis considerándola como aglutinación negativa.

2. Problemas con la muestra:

• Presencia de Autoanticuerpos.
• Antígenos A o B débiles, congénitos o adquiridos.
• Especificidad B adquirida en pacientes A1 por una infección bacteriana.
• Inmunodeficiencias congénitas o adquiridas.
• Fenómenos de Rouleaux.

ACTIVIDADES.

1. ¿Que son los hematíes tipados ? son los que sabemos de que grupo son.
2. ¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente? al 5%
3. ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica ? suero del paciente inactivado o plasma.
4. ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación ? Que hemos cometido algún error.

Resultados obtenidos

	Aglutinación	No aglutinación
Tubo A1
Tubo A2	+
Tubo B
Tubo 0
Tubo C

Valoración de los resultados

• Los Ac encontrados en el suero son:

_ Anti-A2 _ Autoanticuerpos

• El grupo eritrocitario de la sangre analizada es:

 A

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO. 23/4/15

Fundamento

Los hematíes problema contienen las sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos.

El resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes.

Material necesario

• Tubos de centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipetas Pasteur.
• Centrífuga.
• Gradillas.

Reactivos

• Suero anti-A.
• Suero anti-B.
• Suero anti-AB.
• Solución salina fisiológica.

Muestra

• Sangre total anticoagulada. Para esta técnica es preferible usar una suspensión de los hematíes problema.

Técnica

1. En primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello rotulamos convenientemente un tubo de centrífuga y añadimos 1 ml de la muestra de sangre. Completamos el tubo con solución salina y agitamos para suspender los hematíes. Centrifugamos 4 minutos a 2.000 r.p.m y decantamos el sobrenadante.
2. A los hematíes del tubo les añadimos una cantidad suficiente de solución salina como para obtener una suspensión al 2%. Esto es aproximado, aunque debemos establecer los límites entre el 2 y el 4%.
3. Rotular tres tubos de ensayo bien limpios con las letras A, B y AB.
4. Añadir a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2%.
5. Añadir dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B en el tubo B, y dos gotas de anti-AB en el tubo AB.
6. Centrifugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m o 30 segundos a 3.000 r.p.m (centrifuga de inmunohematología)

Lectura de resultados

Después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

Reacción negativa: Los hematíes se resuspenden homogéneamente.

Reacción positiva: Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Se realizan igual que en la técnica en porta.

Es importante destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en los tubos pueden ocasionar falsos negativos.

También pueden darse falsos positivos, principalmente por dos motivos:

• Aglutinación no específica: Se debe a la presencia de ácido hialurónico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, y se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes.
• Fenómeno de Rouleaux: Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que más frecuentemente originan este fenómeno son: el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.

Estos fenómenos pueden evitarse con el lavado previo de los hematíes problema.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ? La aglutinación.
2. ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problema ? Al 2% o también se puede al 4 %.
3. ¿Cómo se ve una aglutinación positiva ? Se observa un botón de hematíes .
4. ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux ?  al fibrinógeno, las gammaglobulinas ,el dextrano y la polivinilpirrolidona.
5. ¿Cómo pueden evitarse los falsos positivos ? Con el lavado previo de los hematíes problema 

Resultados obtenidos

Valoración de los resultados obtenidos

La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:

 A

 DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA. 22/4/15

INTRODUCCIÓN

La detección celular del grupo ABO puede realizarse mediante una técnica en porta o en tubo.

En ambos casos, los hematíes problema, que contienen sustancias antigénicas (aglutinógenos) del sistema ABO, se enfrentan con antisueros (aglutininas) dirigidos contra esos antígenos.

El resultado final de esta determinación consiste en la aglutinación directa de los eritrocitos cuando reacción contra el antisuero que les corresponde.

Para estos estudios in vitro se utilizan anticuerpos anti-A, anti-B y anti-AB procedentes de donantes o que se obtienen mediante síntesis con hibridomas de linfocitos sensibilizados y células de mieloma múltiple (Ac monoclonales*). Sin embargo, como aglutininas anti-A1 o anti-H se utilizan lectinas.

Las lectinas o fitoaglutininas son proteínas presentes en algunas plantas, sobre todo en sus semillas, capaces de aglutinar a los hematíes humanos. Una de ellas, extraída de las semillas de la leguminosa Ulex europeaus, es capaz de aglutinar específicamente los hematíes que contienen sustancia H, y también es eficaz para detectar esta sustancia en la saliva, por lo que se utiliza para identificar a los individuos secretores. El extracto de la semilla de otra leguminosa, Dolichos biflorus, puede aglutinar a los hematíes A1 y A1B no aglutina a los hematíes A2, A2B B y O.

Es importante mencionar que todas estas determinaciones deben hacerse a temperatura ambiente, ya que la aplicación de calor puede afectar a los hematíes impidiendo observar una posible aglutinación.

Fundamento

Consiste en observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo ABO del individuo.

Material necesario

• Un portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco.
• Un rotulador de vidrio.
• Una pipeta pasteur desechable.
• Palillos mezcladores.
• Un reloj.

Reactivos

• Suero anti-A.
• Suero anti-B.

Muestra

• Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

Técnica

• Dividir un portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio. Marcar una con la letra A y otra con la letra B.
• Depositar una gota de suero anti-A (azul) en la sección A del portaobjetos, y una gota del suero anti-B (amarillo) en la sección B.
• Situar una pequeña gota de sangre (aproximadamente la mitad del volumen usado de antisuero) junto a la gota de antisuero.
• Mezclar ambas gotas en cada sección utilizando un palillo distinto en cada una de ellas y formando un círculo de 2 a 2,5 cm de diámetro.
• Hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia atrás, durante dos minutos.
• Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Lectura de resultados

Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro. En el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

La presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante examen microscópico de las mezclas.

En general estas pruebas son muy eficaces ya que la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacción y el tamaño de los grumos. El resultado puede observarse en unos segundos, aunque conviene reexaminar la reacción del anti-A al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil. Éstas suelen ocurrir en menos de un 1% de las muestras analizadas.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

El grupo eritrocitario que se le asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el cuadro siguiente:

Hematíes y suero anti-A	Hematíes y suero anti-B	Grupo eritrocitario
+	-	A
-	+	B
+	+	AB
-	-	0

+ = presencia de aglutinación

˗ = ausencia de aglutinación

En el caso de que el grupo obtenido sea el A, los hematíes problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina anti-A1: de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al subgrupo A1.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ? La aglutinación.
2. ¿Qué muestra utilizamos ? Sangre capilar.
3. ¿Cómo se ve la aglutinación positiva ?Grumos rojos que flotan sobre el líquido antisuero.
4. ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A? Reexaminar la reacción del anti -A1 al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil.

Resultados obtenidos

Valoración de los resultados

La sangre analizada es del grupo eritrocitario:

 A2

 PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL.

INTRODUCCIÓN

Las pruebas de mezclas se realizan cuando alguno de los tiempos determinados en el plasma problema (generalmente, el TPPA) está alargado. Para llevarlas a cabo se mezclan, a partes iguales, el plasma problema y un plasma o un suero (según el tipo de prueba que se pretende realizar) que se sabe que es normal. Tras lo cual, se incuba la mezcla a 37°C durante 60 minutos.

Si los tiempos determinados en la mezcla se corrigen, falta algún factor en el plasma problema y su carencia ha sido compensada con el aporte suplementario de factores contenidos en el plasma o en el suero normales.

Fundamento

La prueba de mezcla con el plasma normal se practica, generalmente, cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TPPA alargado. En esta circunstancia se supone que el paciente sufre un déficit de algún factor de la vía intrínseca y, en concreto, de los factores VIII, IX, XI o XII.

Para llevarla a cabo, se mezcla, a partes iguales, el PPP problema con PPP normal, y se repite la determinación del TTPA, pero no en el PPP problema puro, sino en la mezcla preparada. Tras lo cual, se incuba la mezcla a 37°C durante 60 minutos.

Si el TTPA determinado en la mezcla se corrige, falta, en el plasma problema, alguno de los factores de la vía intrínseca que, sin embargo, sí está presente en el PPP normal.

Si el TTPA de la mezcla no se corrige con respecto al del PPP problema puro, el trastorno coagulatorio se debe a otros motivos como, por ejemplo, a la actuación de sustancias inhibidoras de la coagulación.

Material necesario

• Una gradilla.
• 2 cubetas de coagulómetro.
• 2 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 µl.
• 4 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 µl (las de color amarillo).
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37°C.
• 3 tubos de ensayo de plástico.

Reactivos

• Una solución de cloruro cálcico 0,025 M (por ejemplo, la preparada por los Laboratorios Pacific Hemostasis y distribuida por la casa comercial RAL).
• Una cefalina activada con ácido elágico (por ejemplo, el reactivo APTT-XL de los Laboratorios Pacific Hemostasis).
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los Laboratorios Pacific Hemostasis).

Muestra

• Un plasma sobre un plaquetas (PPP), correctamente preparado y con un TTPA claramente anómalo, es decir, alargado.

A partir del PPP anómalo hay que preparar una dilución a ½ con el pool de plasmas normales o con el plasma normal. Esto puede hacerse de la siguiente forma:

PPP anómalo	100 µL
Pool de plasmas normales o Plasma control normal	100 µL
Dilución	1/2

• La dilución de la muestra (la mezcla) se ha de incubar a 37°C, durante 60 minutos.

Técnica

1. Homogeneizar el cloruro cálcico, la cefalina activada y la dilución de la muestra, sin agitarlos bruscamente.
2. Depositar el volumen total que se va a necesitar del cloruro cálcico, de la cefalina activada y de la dilución de la muestra, en 3 tubos de ensayo de plástico, adecuadamente rotulados.
3. Atemperar los reactivos, a 37°C durante 5 a 15 minutos.
4. Tomar 2 cubetas de coagulómetro e introducir un trocito de acero en cada una de ellas.
5. Rotulador el extremo superior de las cubetas del coagulómetro con las siglas M1 y M2.
6. Verter 100 µl de la dilución de la muestra en cada una de las cubetas.
7. Añadir, a lo anterior, 100 µl de cefalina activada (APTT-XL).
8. Mezclar bien la cefalina activada con el resto del contenido de cada cubeta. Esto puede realizarse en el momento en el que se añade la cefalina activada, mediante la ejecución de aspiraciones y expulsiones sucesivas de la mezcla, con la pipeta automática.
9. Incubar la mezcla, contenida en cada cubeta, a 37°C, durante 2 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
10. Colocar, sucesivamente, cada una de las 2 cubetas en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 100 µl de CaCl2 0,025 M.

Al agregar el CaCl2, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza le lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición del CaCl2.

Lectura de resultados

El TTPA es el tiempo trascurrido desde la adición del CaCl2 hasta la formación del coágulo de fibrina.

Los valores normales del TTPA están comprendidos, habitualmente, entre los 30 y los 40 segundos. Un tiempo superior a estos valores se considera alargado.

Como el TTPA de la dilución de la muestra se determina dos veces, se calcula la cifra media de esta pareja de valores. Este valor medio es el resultado final de la determinación.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Si el TP es normal y el TTPA está alargado, el enfermo, probablemente, padecerá un trastorno de la vía intrínseca.

En este caso, se debe repetir la determinación del TTPA, pero incubando la mezcla de plasma y cefalina activada durante 15 minutos. Si con este cambio se corrige el alargamiento del TTPA, es decir, se toma normal, probablemente, hay un déficit de PK.

Cuando, tras aumentar el tiempo de incubación, no se corrige el TTPA, tiene que hacerse una prueba de mezcla con el plasma normal.

Si tras la mezcla con plasma normal, el TTPA se corrige, es decir, deja de estar alargado, falta algún factor de la vía intrínseca (F. VIII, IX, XI o XIII) en la muestra y su carencia ha sido compensada con el aparte suplementario de factores contenidos en el plasma normal.

Si, por el contrario, tras la mezcla con el plasma normal, no se corrige el TTPA, se debe investigar la presencia en el plasma de un inhibidor de la coagulación 8heparina, PDF, inhibidor tipo lupus, etc.).

ACTIVIDADES

1º ¿Cuándo debe hacerse la prueba de mezcla con plasma normal  ?cuando en el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado .

2º Si tras la mezcla con plasma normal ,no se corrige el TTPA, ¿qué se debe investigar ?la presencia de un inhibidor de la coagulación (heparina ,PDF,..).

Resultados obtenidos

Tras la mezcla del plasma problema anómalo con plasma normal:

No se ha corregido el TTPA.

Valoración de los resultados

La prueba realizada indica:

 La presencia de un inhibidor de la coagulación en el plasma anómalo.

 DETERMINACIÓN FUNCIONAL DEL FIBRINÓGENO. 9/3/15

INTRODUCCIÓN

El fibrinógeno plasmático puede ser cuantificado mediante diferentes métodos. Sin embargo, actualmente, sólo se suelen utilizar aquellos que exploran sus capacidades funcionales o antigénicas.

Fundamento

La determinación cronométrica de fibrinógeno, según el método de von Clauss, se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina de degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coágulo.

El tiempo que tarda en originarse el coágulo de fibrina depende, exclusivamente, de la cantidad inicial de fibrinógeno y es inversamente proporcional a la concentración de éste en el plasma estudiado (fibrinogenemia).

En estas condiciones, el logaritmo del tiempo de coagulación está en relación lineal con el logaritmo de la fibrinogenemia.

Material necesario

• Una gradilla.
• 8 tubos de ensayo de plástico.
• Una prepipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1ml (1.000 µl) y otra de 2ml (2.000 µl) de capacidad.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.
• 9 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl (las de color amarillo).
• Un rotulado de vidrio de punta fina.
• 7 cubetas de coagulómetro.
• 7 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un bolígrafo.
• Una hoja de papel de tipo logarítmico-logarítmico. También se puede utilizar un papel especial como, por ejemplo, el Fibri-Graph suministrado por los Laboratorios bioMérieux.

Reactivos

• Un Fibrinogène-Kit de los laboratorios bioMérieux. Este Kit contiene 2 reactivos.

-Reactivo 1: es trombina bovina a una concentración de 100 U NIH/ml.

Con esta concentración tal alta de trombina la prueba no se ve interferida por niveles terapéuticos de heparina; aunque sí puede ser falseada por niveles muy altos de PDF.

Cada vial de reactivo 1 contiene un liofilizado que debe ser reconstituido con 3 ml de agua destilada.

-Reactivo 2: es tampón veronal a pH 7,35.

Contiene también un anticoagulante y un antifibrinolítico.

Se utiliza para diluir el plasma calibrado y la muestra.

También se puede emplear la trombina bovina elaborada por cualquier otro laboratorio comercial (por ejemplo, la de Pacific Hemostasis) y un tampón imidazol.

• Un plasma calibrador o de referencia: es un plasma cuya concentración de fibrinógeno es conocida.

Como plasma calibrador se puede utilizar el Caliplasma preparado por los Laboratorios bioMérieux. Éste contiene fibrinógeno a una concentración que está indicada en el folleto que se adjunta con el reactivo.

• Agua destilada.

Muestra

• Un plasma pobre en plaquetas (PPP), correctamente preparado.

Técnica

1. Homogeneizar los reactivos, sin agitarlo bruscamente.
2. Diluir el plasma calibrador y la muestra, de la manera que se indica en el siguiente cuadro:

Plasma calibrado (en µl)	100	100	100	100	100	100	100
Muestra (en µl)	0	0	0	0	0	0	100
Tampón veronal (en µl)	400	900	1.400	1.900	2.400	2.900	900
Dilución	1/5	1/10	1/15	1/20	1/25	1/30	1/10
Fibrinogenemia	Cx2	C	C/1,5	C/2	C/2,5	C/3	¿

C = concentración del fibrinógeno en el plasma calibrador.

3. Depositar el volumen total de trombina bovina que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
4. Atemperar la trombina bovina a temperatura ambiente (20-25°C). Si se utiliza la trombina de los laboratorios torios Pacific Hemostasis, hay que atemperarla a 37°C.
5. Introducir un trocito de acero apropiado en 7 cubetas de coagulómetro.
6. Rotular el extremo superior de 6 cubetas con las concentraciones: Cx2, C, C/1,5, C/2, C/2,5 y C/3; y el de otra cubeta con la letra M (de Muestra).
7. Verter 200 µl de cada una de las diluciones del plasma calibrador y de la muestra en sus cubetas correspondientes.
8. Incubar las diluciones del plasma calibrador y la muestra, contenidas en las cubetas, a 37°C, durante 2 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
9. Colocar, sucesivamente, cada una de las cubetas en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 100 µl de trombina bovina.

Al agregar la trombina, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo trascurrido desde la adición de la trombina.

Lectura de resultados

Lo más correcto es determinar tres veces el tiempo en el que coagulan la muestra y las diluciones del plasma calibrador, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

Si el resultado final determinado en la muestra es menor que 7 segundos, la fibrinogenemia es muy alta, por lo que se ha de repetir la determinación, pero partiendo de una dilución de 1/20 (100 µl de muestra de tampón veronal), y el resultado nuevo se debe multiplicar por 2.

Sin embargo, si el resultado final determinado en la muestra es mayor que 40 segundos, la fibrinogenemia es muy baja, por lo que se ha de repetir la determinación, pero partiendo de una dilución de 1/5 (100 µl de muestra + 400 µl de tampón veronal), y el resultado nuevo se debe dividir entre 2.

Para establecer la fibrinogenemia de la muestra se ha de trazar, previamente, en papel bilogarítmico, una curva de referencia o de calibración. Para ello, se anotan en el eje de ordenadas (el vertical), los valores en segundos del tiempo en el que coagulan cada una de las diluciones del plasma calibrador, y en el eje de abscisas (el horizontal), las concentraciones de fibrinógeno que corresponden a cada una de ellas.

Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluye cada valor de tiempo de coagulación con su fibrinogenemia correspondiente. A continuación, se dibuja la recta que mejor une los 6 puntos.

Finalmente, el valor en segundos del tiempo de coagulación determinado en la muestra, se interpola en la curva de calibración, previamente preparada, y se halla la concentración de fibrinógeno que le corresponde a éste.

La fibrinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 mg/dl.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

La formación de fibrinógeno y, por tanto, su concentración plasmática puede estar disminuida por trastornos congénitos (afibrinogenemia congénita) o adquiridos (hepatopatías).

La fibrinogenemia asciende, de una forma inespecífica, en multitud de procesos inflamatorios, debido a que es un reactante de fase aguda.

ACTIVIDADES.

1. ¿De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?
2. ¿A qué concentración está la trombina bovina? 100%
3. ¿A qué dilución se somete a la muestra? 1/10
4. ¿Cuál es la fibrinogenemia normal? ENTRE 150 Y 450 SEGUNDOS

 PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA. 6/3/15

INTRODUCCIÓN

Los resultados de una determinación del tiempo de protombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (Índice de Quick).

Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos de TP determinado en el plasma problema.

Fundamento

Para construir una curva de actividad de la protombina se prepara una batería de diluciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normal no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.

Tras ello, se asigna el 100% de actividad al número de segundos medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.

Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protombina), anotando, en el eje de ordenadas (el vertical), los valores, en segundos, del TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones y, en el eje de abscisas (el horizontal), el % de actividad asignado a casa uno de ellos.

Material necesario

• 8 tubos de ensayo de plástico.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una prepipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1.000 µl) de capacidad de dispensión.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.
• 7 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl (las de color amarillo).
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37°C.
• Un bolígrafo.
• Una regla.
• Una hoja de papel milimetrado. También se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
• Una gradilla.

Reactivos

• Solución salina al 0,85% o, mejor aún, tampón de Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:

Dietil-barbiturato de sodio………………………2,94 g

Acetato de sodio…………………………………….. 1,94 g

Agua destilada c.s.p………………………………….100 ml

• Una tromboplastina cálcica.
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal.

A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85% o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	½	1/3	¼	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asignado a cada dilución.

Técnica

1. Homogeneizar la tromboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
2. Depositar el volumen total del tromboplastina cálcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37°C. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37°C, entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50. El de otra con el de 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
6. Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
7. Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37°C, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar, sucesivamente, cada una de las 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de resultados

El TP es el tiempo trascurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y de cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

Para construir la curva de actividad de la protombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas o de las y (el vertical), los valores, en segundo, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones y, en el eje de abscisas o de las x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.

ACTIVIDADES.

1. ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal? CON SUERO SALINO.
2. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de ½? 50
3. ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro? CUANDO SE LE AÑADE TROOMBOPLASTINA CALCICA.
4. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas? LOS VALORES EN SEGUNDOS.

Resultados obtenidos

	Tiempo de Protombina (TP)
Plasma control no diluido (de 100% de actividad)	26,5 SEGUNDOS
Plasma control diluido a ½ (de 50% de actividad)	22,1 SEGUNDOS
Plasma control diluido a 1/3 (de 33% de actividad)	0,5 SEGUNDOS
Plasma control diluido a ¼ (de 25% de actividad)	26,3 SEGUNDOS
Plasma de control diluido a 1/10 (de 10% de actividad)	76,4 SEGUNDOS

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTOMBINA (TP)

INTRODUCCIÓN

El tiempo de protombina (TP) es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística.

Fundamento

El reactivo utilizado para la realización de esta prueba es una mezcla de tromboplastina hística (TH) y de calcio, por lo que recibe el nombre de tromboplastina cálcica.

La TH procede de extractos de cerebro o de pulmón, de hombre o de animales (generalmente, de conejo o de vaca).

Material necesario

• Una gradilla
• Una cubeta de coagulómetro.
• Un trocito de acero especial para depositar en el interior de la cubeta.
• Un rotulado de vidrio de punta fina.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.
• 2 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl ( las de color amarillo).
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37°C.
• 2 tubos de ensayo de plástico.

Reactivos

• Una tromboplastina cálcica (por ejemplo, reactivo Thromboplastina-D preparado por los Laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la Casa comercial RAL).

La sensibilidad de todas las TH comerciales se compara con la de una TH de referencia internacional. Esta comparación se expresa en forma de un Índice de Sensibilidad Internacional (ISI). Cuando menor es el ISI de la TH comercial, mayor es su sensibilidad.

El ISI de cada reactivo de tromboplastina cálcica comercial puede ser diferente y, además, puede variar de un lote a otro. Por lo que debe mirarse en el folleto de instrucciones que se adjuntan a cada envase.

Muestra

• Un plasma pobre en plaquetas (PPP), correctamente preparado.

Técnica

1. Homogeneizar la tromboplastina cálcica, sin agitarla bruscamente.
2. Depositar el volumen total de tromboplastina cálcica que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37°C. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37°C, entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en una cubeta de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de la cubeta con la letra M ( de Muestra).
6. Verter 100 µl del PPP problema en el interior de la cubeta.
7. Incubar el PPP, contenido en esa cubeta, a 37°C, entre 3 y 5 minutos. Para ello, puede depositarse la cubeta en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar la cubeta en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de los resultados

El TP es el tiempo trascurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

Lo más correcto es determinar 2 veces el TP de la muestra y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada par de valores.

El resultado también puede expresarse en forma de porcentaje de actividad de la protrombina. Para ello, el valor en segundos del TP determinado en la muestra se interpola en la curva de actividad de la protombina, previamente preparada, y se halla el porcentaje de actividad de la protrombina que le corresponde a éste.

Además, el resultado puede expresar en forma de cociente o proporción (ratio) entre el valor, en segundos, del TP de la muestra y el de un plasma control normal no diluido (el de 100% de actividad).

Este cociente puede ser corregido con el ISI de la tromboplastina hística, en este caso se denomina INR y se calcula con la siguiente fórmula:

INR = ( TP del plasma del paciente / TP de un plasma control normal) ISI

Los valores del TP están comprendidos, normalmente, entre los 11 y los 15 segundos.

El porcentaje de actividad de la protrombina de un plasma normal oscila, habitualmente, entre el 70 y el 100%.

La ratio de protrombina normal está comprendida entre 0,9 y 1,15.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

El tiempo de protrombina está alargado, el porcentaje de actividad de la protrombina está disminuido y la ratio de protrombina está aumentada, en pacientes con déficits de factores de la vía extrínseca, en enfermos sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes que sufren algunos trastornos hepáticos.

ACTIVIDADES.

1º¿Qué índice expresa la sensibilidad de una tromboplastina hística ? (ISI) Índice de Sensibilidad Internacional.

2º¿Cómo se llama la ratio de protrombina corregida ?(INR) Razon Normalizado Internacional.

3º ¿Cuál es el % normal de actividad de la protrombina ? entre 70 y 100 %

4º¿E n qué circunstancias se altera el TP ?en déficts de factores de la vía extrínseaca,en enfermos sometidos a terapias con dicumarinas y en personas que sufren transtornso hépaticos

Resultados obtenidos

• TP de la muestra en segundos :37,2 seg.
• % de la actividad de la protrombina contenida en la muestra,obtenido mediante interpolación en la curva de actividad preparada previamente :
• TP del plasma control normal no diluido (el de 100% de actividad): 12,3
• Ratio entre el TP de la muestra y el TP del control : 1,32
• ISI de la tromboplastina hística utilizada : 1,24( de la casa comercial ).

Valoración de los resultados

La muestra ensayada tiene un TP:

Alargado