PRUEBA CURZADA MAYOR. 22/5/15

INTRODUCCIÓN

El objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar La posibles reacciones antígeno-anticuerpo entre la sangre del donante y del receptor, antes de la transfusión-

Por ello, es imprescindible realizar una serie de determinaciones que se especifican a continuación:

1. Tipaje correcto del grupo AB0 y Rh del donante y del receptor. Siempre se intentará transfundir sangre del mismo grupo del receptor, y si no es posible, se usará una sangre compatible.
2. Escrutinio de los anticuerpos irregulares del receptor: Si se detectan anticuerpos irregulares, deberán ser identificados para administrar sangre que carezca de los antígenos correspondientes. No es imprescindible realizar esta determinación en la sangre del donante, ya que el volumen de plasma transfundido es pequeño en comparación con el plasma del receptor, pero sí es conveniente hacerla para evitar todo tipo de riesgos.
3. Prueba cruzada mayor. Trata de determinar la incompatibilidad entre las sangres enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante.

Otras pruebas que también pueden realizarse son: la prueba cruzada menor, donde se enfrentan el suero del donante con los hematíes del receptor, y un autocontrol, donde se buscan Autoanticuerpos mediante el enfrentamiento entre el suero del receptor y sus propios hematíes.

La prueba cruzada menor sólo se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa. El empleo de concentrados de hematíes hace innecesaria la realización de esta prueba.

Todas estas pruebas deben realizarse en medio salino y en medio albuminoso, para detectar todos los anticuerpos presentes.

Fundamento

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante; primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero antiglobulina de Coombs. Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

Material necesario

• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.
• Reloj.

Reactivos

• Solución salina fisiológica.
• Albúmina bovina al 30%.
• Suero antiglobulina de Coombs.

Muestra

• Suero del receptor, obtenido se sangre coagulada y libre de hemólisis. Debe ser fresco (menos de 24 horas desde la extracción) y conservado a 4°C.
• Hematíes del donante, previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y resuspendidos en ella al 2-5%.

Técnica

1. En un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del donante y 2 gotas del suero del receptor.
2. Mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
3. Centrifugamos a 3.500 r.p.m durante 30 segundos.
4. Leemos el resultado obtenido en medio salino.
5. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina bovina al 30%.
6. Mezclamos bien e incubamos a 37°C durante 30 minutos.
7. Centrifugamos a 3.500 r.p.m durante 30 segundos.
8. Leer el resultado obtenido en medio albuminoso.
9. Lavamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retirar bien todo el sobrenadante el último lavado.
10. Añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs. Mezclar bien.
11. Centrifugamos a 1.000 r.p.m durante 2 minutos.
12. Leemos los resultados.

Lectura de resultados

La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones.

En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40x.

INTERPRATACION CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y por tanto, la transfusión es posible.

La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.

Si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo de incompatibilidad.

En ocasiones es conveniente realizar esta prueba en medio enzimático. Dado que el empleo de enzimas como de Bromelina o la Papaína refuerza las reacciones antígeno-anticuerpo, esta prueba se usa para re-examinar a los receptores que han sufrido reacciones trasnfusionales.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor ? suero del receptor y hematíes del donante.
2. ¿Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor ? cuando se enfrenta el suero del donante con los hematíes del recetor.
3. ¿ Por qué  debemos realizar la prueba en medio salino y albumininoideo ? Para detectar todos los antígenos presentes.
4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs ? Para detectar los anticuerpos que hayan quedados fijados a la membrana eritrocitaria.

Resultados obtenidos

	Resultados
Medio salino	NO AGLUTINA
Medio albuminoso	NO AGLUTINA
Suero antiglobulina	NO AGLUTINA

Valoración de los resultados

Las sangres analizadas son:

Compatibles

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA. 21/5/15

INTRODUCCIÓN

En las normas para la selección de donantes de sangre se establece que la concentración de Hb debe ser determinada cada vez que haya una donación.

Además, se señala que los valores mínimos antes de donar han de ser los siguientes:

• 12,5 g/dl, en el caso de mujeres.
• 13,5 g/dl, en el caso de hombres.

Los donantes sólo podrán aceptarse por debajo de estos niveles si el criterio del médico responsable así lo considera oportuno.

Fundamento

Para determinar la concentración de hemoglobina, justo antes de una donación, es necesario un método rápido aunque no se muy preciso.

Esta determinación rápida de Hb se basa en el hecho de que una sangre con una concentración de Hb superior a la permitida, para poder efectuar una donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre previamente preparada. Por lo que, en estas circunstancias, una gota de la sangre investigada cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre.

Para donantes varones se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1,054 g/cmᵌ, ya que a través de esta solución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a 13 g/dl.

Para mujeres donantes se debe preparar una solución de sulfato de cobre de densidad igual a 1,052 g/cmᵌ, que a través de esta solución cae libremente una gota de sangre con Hb a una concentración superior a 12 g/dl.

Material necesario

• Material de extracción de sangre capilar.
• Un vaso de precipitados de 50 ml.

Reactivos

• Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,052g/dl. Ésta se prepara de la siguiente manera:

1. Disolver 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada (solución madre).

La densidad de la solución de sulfato de cobre varía con la temperatura. Así pues, por ejemplo, para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22°C, se han de añadir 0,74 ml más de agua destilada.

2. Mezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

Los Laboratorios Panreac proporcionan una solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,050 g/dl (referencia 252195).

Muestra

• Sangre capilar adecuadamente recogida. Suele realizarse sobre la porción lateral del pulpejo del quinto dedo.

Técnica

1. Disponer la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitados de 50 ml.
2. Recoger una gota de sangre problema.
3. Dejar caer la gota de la sangre problema, con algo de impulso, sobre la solución de sulfato de cobre.

Lectura de resultados

Si la gota de sangre problema es más densa que la solución de sulfato de cobre, cae libremente a través de ella.

Sin embargo, si la gota de sangre problema es menos densa que la solución de sulfato de cobre, no cae al fondo del vaso de precipitados que contiene esta solución.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Una gota de sangre con más de 12 g/dl de Hb tiene una densidad mayor que 1,052 g/cmᵌ.

Si la gota de sangre problema cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre, tiene una densidad mayor que 1,052 g/cmᵌ y, por lo tanto, tiene una concentración de Hb superior a 12 g/dl.

Si la sangre problema tiene una concentración de Hb superior a 12 g/dl, el sujeto puede donar sangre.

En el caso contrario, la donación no puede ser efectuada

ACTIVIDADES.

1. ¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación ? 12,5g/dl .
2. ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre ?con solución de sulfato de cobre a una densidad de 1,052g/dl

Resultados obtenidos

Valoración de los resultados

El donante es apto:

Si

DETERMINACIÓN DE  Dᵁ. 20/5/15

INTRODUCCIÓN

En algunos casos, los anticuerpos tipo IgG (o incompletos) son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes por sí solos. Sin embargo, son capaces de adherirse a su superficie tanto in vivo como in vitro, y decimos que han sensibilizado a los hematíes. También son capaces de fijar el complemento, sin llegar a producir la hemólisis de los eritrocitos.

Estos anticuerpos tipo IgG pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen anticuerpos antiglobulina humana del tipo IgM (complementos). El resultado de esta reacción es una aglutinación de los hematíes.

Este suero antiglobulina humana es lo que llamamos suero de Coombs. Este suero puede ser de dos tipos:

• Poliespecífico, si está dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento.
• Monoespecífico, si está dirigido sólo contra la IgG o contra alguno de los componentes del complemento.

La prueba de Coombs o de la antiglobulina humana puede realizarse de dos modos:

• Prueba directa, donde intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo. Para ello los enfrentamos directamente al suero de Coombs y observamos si existe o no, aglutinación.
• Prueba indirecta, donde el paso previo es la sensibilización de los eritrocitos in vitro, para posteriormente hacerlos reaccionar con el suero de Coombs. En este caso buscamos anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes

Fundamento

El Dᵁ es un antígeno D débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación del Rh. Por ello debemos sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti-D, y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno Dᵁ en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana, en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.

Es una prueba de Coombs indirecta.

Material necesario

• Tubos de centrífuga o de hemólisis.
• Centrifuga.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.
• Baño de agua.
• Reloj.

Reactivos.

• Suero antiglobulina humana de conejo (suero de Coombs).
• Solución salina fisiológica.

Muestra

• Hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica, y suspendidos al 5% en dicha solución.

Técnica

1. En un tubo de hemólisis colocamos una gota de suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes al 5%.
2. Mezclamos suavemente e incubamos a 37°C durante 30-45 minutos.
3. Después de incubar, lavamos los hematíes en solución salina fisiológica tres veces consecutivas.

Decantamos completamente la solución salina después del último lavado.

4. Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs, y mezclamos suavemente.
5. Centrifugamos el tubo a 1.000 r.p.m durante un minuto.

Lectura de resultados

Observamos la aparición o no de aglutinación, mediante golpes suaves en el fondo del tubo. En caso de duda, observamos al microscopio entre porta y cubre con el objetivo de 40x.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Si existe aglutinación, el resultado es positivo. Indica que en la membrana de los hematíes hay antígenos Dᵁ, y se clasifica la sangre como Rh positivo variante Dᵁ.

En el caso de no existir aglutinación se clasificará la sangre como Rh negativo.

Para evitar falsos positivos debido a una sensibilización previa de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes problema. Esto nos servirá como control negativo.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué contiene el suero de Coombs ? suero antiglobulina humana de conejo.
2. ¿Qué se detecta con la prueba directa ? un falso positivo.
3. ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta? un Rh + Du (débil).
4. ¿Qué buscamos en la sangre del paciente ? antígeno Du.
5. ¿Qué ocurre si el control es positivo ? que la membrana de los hematíes del aciente hay antígeno Du

Resultados obtenidos

	Aglutinación
Sección S	+
Sección A	-

Valoración de los resultados

La sangre es:

 Rh positivo

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh. 7/5/15

INTRODUCCIÓN

El genotipo de una persona es su dotación genética en el cromosoma, y el fenotipo es la manifestación de ese genotipo. En el caso de los sistemas de grupo sanguíneo se puede considerar el fenotipo como la suma total de antígenos detectados en los hematíes mediante el empleo de antisueros específicos.

En algunos casos, el fenotipo es idéntico al genotipo. En el sistema Rh, esto sólo ocurre en contadas ocasiones.

Dado que no existe el antígeno d, ni el anticuerpo anti-d, es imposible determinar si el antígeno D es homozigoto o heterozigoto mediante su detección en los hematíes. Por ello, sólo podemos determinar el genotipo de una persona en base a datos estadísticos, es decir, para un fenotipo obtenido, buscar el genotipo más probable.

El interés en la determinación del genotipo se debe a que existen casos de madres inmunizadas frente a D, y conviene conocer si el padre es o no homozigoto para D, antes de producirse un nuevo embarazo. Un padre homozigoto D transmitirá el gen D a todos sus hijos, mientras que uno heterozigoto lo transmitirá con un 50% de probabilidades.

El fenotipo se determina enfrentando los hematíes problema con los antisueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e.

Posteriormente, se buscan los haplotipos posibles y se determinan en base a estudios genealógicos que establecen las combinaciones más frecuentes en la población analizada.

Es importante tener en cuenta que el genotipo más probable dependerá de la raza o el grupo étnico al que pertenezca el individuo estudiado.

Fundamento

Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

La existencia o no de estos antígenos en la superficie de los hematíes se detecta por una reacción de aglutinación. Los resultados de estas reacciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes.

Material necesario

• Tubos de centrífuga.
• Centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipetas Pasteur desechables.
• Gradilla.

Reactivos

• Suero anti-D.
• Suero anti-E.
• Suero anti-C.
• Suero anti-e.
• Suero anti-c.
• Solución salina fisiológica.

Muestra

• Suspensión de hematíes lavados, al 5% en solución salina fisiológica.

Técnica

1. Procedemos al lavado de los hematíes y a preparar su suspensión al 5% según la técnica descrita en la práctica LIX.
2. Rotulamos cinco tubos de centrífuga, cada uno con la letra D, C, E, c y e.
3. En cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Homogeneizamos suavemente.
4. Centrifugamos todos los tubos durante un minuto a 1.000 r.p.m

Lectura de resultados

Golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos medio y anular en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático.

El resultado positivo es la presencia de aglutinación, y se observa con la presencia de grumos rojos sobre un líquido claro.

La ausencia de aglutinación es un resultado negativo, y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo. El resultado negativo indica lo contrario.

Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh que se encuentran en la figura 53.LXI.2.

Una vez encontrada la hilera coincidente, se mira en ella el posible o posibles genotipos correspondientes.

Esto es así porque si la sangre analizada es Rh negativa (D-), se puede determinar su único genotipo posible con respecto al sistema Rh. Sin embargo, si la sangre es Rh positiva (D+), existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué antisueros se utilizan en está técnica ? Antisueros D,E,C,e y c.
2. ¿Por qué no existe suero anti-d? Por que no hay antígeno d.
3. ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos ? El fenotipo de la sangre analizada.
4. Si la sangre es Rh +,¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh ? No, porque existen varios genotipos posibles.
5. Si los resultados obtenidos son : D-, C- , E+ ,c+ y e- ; ¿cuál es el genotipo posible de esta sangre ? dcE/dce ( según Fisher-Racer ).

Resultados obtenidos

Tubos	Aglutinación
D	-
C	+
E	+
C	+
E	+

Valoración de los resultados

El/los genotipos/s posible/s del sistema Rh en la sangre analizada es/son:

dCe/dcE     dCE/dce (según Fisher-Race )

Si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que el paciente es Rh positivo.

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO. 5/5/15

INTRODUCCIÓN

Para la realización de estas técnicas (en porta o en tubo) empleamos unos sueros anti-D que pueden ser de dos tipos: salino o albuminoideo. Estos últimos son los más utilizados y se preparan en un medio enriquecido con albúmina.

Los hematíes pueden revertirse in vivo de anticuerpos o proteínas anormales, y en presencia de albúmina producir una agregación que daría la idea de una aglutinación positiva. Por ello empleamos un control de albúmina, de manera que si aparece aglutinación en este tubo debemos repetir la prueba, pero usando un suero anti-D en medio salino.

Fundamento

Al igual que en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes median su enfrentamiento a un suero anti-D.

Material necesario

• Tubos de centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.
• Pipetas Pasteur.
• Centrífuga.

Reactivos

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%.
• Solución salina fisiológica (al 0,9%).

Muestra

• Hematíes problema preparados en suspensión al 5%.

Antes de proceder a suspender los hematíes debemos lavarlos tres veces en solución salina fisiológica. Para ello tomamos un volumen aproximado de 0,5 ml de la sangre problema y la llevamos a un tubo de centrífuga. Completamos el tubo con solución salina y agitamos suavemente para resuspender los hematíes. Centrifugamos durante 4 minutos al 2.000 r.p.m. Posteriormente retiramos el sobrenadante y repetimos el proceso dos veces más.

El sedimento hemático resultante se resuspende en la cantidad de solución salina necesaria para obtener una suspensión al 5%.

Técnica

1. Rotulamos dos tubos limpios con las letras D y A.
2. En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y el tubo A ponemos una gota de albúmina bovina al 30%.
3. A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Agitamos suavemente para mezclar el contenido de los tubos.
4. Centrifugamos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m o 30 segundos a 3.5000 r.p.m.

Lectura de resultados

Con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeaos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático.

Se considera aglutinación positiva si se forman grumos de color rojo en un líquido claro.

Por el contrario, si se resuspenden homogéneamente los hematíes, decimos que la aglutinación es negativa.

El tubo con albúmina es un control negativo, y debe dar siempre ausencia de aglutinación. En caso de no ser así, el resultado de la prueba no es válido.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Si no se produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedentes a incubar ambos a 37°C durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1.000 r.p.m durante un minuto y observamos si existe o no aglutinación.

En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un Dᵁ (D débil) mediante una prueba de Coombs indirecta.

Si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinación, informaremos que el paciente es Rh negativo.

ACTIVIDADES.

1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina ? para saber si la prueba es válida.
2. ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D? que no es Rh positivo
3. ¿Qué decimos detectar mediante un Coombs indirecto ? que el paciente no posee un Du (débil ).
4. ¿Como se prepara la muestra problema ? Cojo 2 tubos de centrifuga y la añado 0,5 ml de sangre de la bolsa problema y le añado suero salino hasta la mitad del tubo para igualarlos y lo meto en la centrifuga a 2000 r.p.m por 4 minutos.Le retiro el sobrenadante y repito la misma operación de lavado  2 veces más.El sedimento que me queda cojo 5 gotas y las pongo en otro tubo y le añado 5 ml de suero salino,la homogeneizo y esta es la suspensión que necesito para analizar.

Resultados obtenidos

	Aglutinación
Sección S	+
Sección A	-

Valoración de los resultados

La sangre analizada es:

 Rh positivo

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA. 4/5/15

INTRODUCCIÓN

Al igual que en el caso del grupo AB0, podemos determinar el grupo Rh tanto en porta como en tubo. Es importante comprobar siempre los resultados obtenidos, bien por la realización de ambas técnicas, o bien, por ser de técnicos los que las realicen en paralelo.

En el caso de la prueba en porta conviene mencionar que la aglutinación favorece por el calor, de manera que es necesario disponer de un visualizador que permia tanto calentar el porta, como observar mejor el resultado de la reacción.

METÓDICA

La técnica está basada en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D.

En el caso de que los hematíes contengan el antígeno D se producirá una aglutinación que puede observarse a simple vista.

Material necesario

• Portaobjetos.
• Pipetas Pasteur.
• Rotulador de vidrio.
• Palillos agitadores.
• Visualizador luminoso.

Reactivos

• Suero anti-D.
• Albúmina bovina al 30%.

Muestra

• Sangre total anticoagulada.

Técnica

1. Dividir el portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcar una con la letra S (suero) y otra con la letra A (albúmina).
2. En la sección S colocamos dos gotas del suero anti-D, y en la sección A ponemos dos gotas de albúmina bovina al 30%.
3. Depositamos una gota de sangre en cada una de las secciones y mezclamos con palillos distintos.
4. Colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado, y lo balanceamos para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.

Lectura de resultados

Esperamos dos minutos antes de dar el resultado de la prueba.

Aglutinación positiva: Aparición de grumo rojos sobre un fondo claro. No deben confundirse con pequeños coágulos de fibrina presentes en la muestra.

Aglutinación negativa: La mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes.

La mezcla de sangre con albúmina bovina debe dar siempre aglutinación negativa. En caso de no ser así, no podemos informar del resultado de la prueba.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro:

Sección S	Sección A	Interpretación
+	-	Rh positivo
-	-	Rh negativo
+	+	¿?

+ = Aglutinación positiva

- = Aglutinación negativa

¿? = No se puede interpretar

Para confirmar un Rh negativo es necesario realizar la prueba en tubo.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica ? sangre total anticoagulada.
2. ¿Para qué se utiliza el visualizador ? para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.
3. ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones ?  pequeños coagulos de fibrina contenidos en la muestra .
4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A ? que no se puede informar los resultados,esta sección debe ser  siempre negativa.

Resultados obtenidos

	Aglutinación
Sección S	+
Sección A	-

Valoración de los resultados

La sangre analizada es:

Rh positivo

PREPARACIÓN DE SUSPENSIÓN DE HEMATÍES TIPADOS(lavado de hematíes ) 24/04/15

PREPARACIÓN DE SUSPENSIÓN DE HEMATÍES TIPADOS(lavado de hematíes ) 24/04/15

MATERIAL

• 4 tubos de centrifuga.
• Pipetas Pasteur.
• 2 vasos de precipitados .
• Gradilla.
• Pipeta graduada de 5ml.
• Rotulador.
• Centrifuga.
• Reloj.
• Bata ,guantes y papel de filtro.
• Papel parafim.

TÉCNICA

1º Cojo un tubo cónico  y pongo 1 ml de sangre la correspondiente al grupo ABO conocido y completo son suero salino hasta la mitad más o menos del tubo. 

3º Centrifugo a 2000 r.p.m. por 4 minutos.

4º Retiro el sobrenadante.

5º Repito dos veces más  y me quedo con el sedimento. 

6º Preparo hematíes al 5 % ( 5 gotas de sedimento + 5 ml de suero salino ).
7º Esta suspensión de hematíes la paso a un frasco cuentagotas y la rotulo B  y le pongo la fecha y la coloco en el frigorífico para la práctica del próximo día.

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO ABO. 27/4/15

INTRODUCCIÓN

La clasificación correcta del grupo sanguíneo en la sangre del donante y del receptor es un paso fundamental en el acto transfusional. Para ello, es imprescindible confirmar el resultado de la prueba celular con la determinación sérica del grupo sanguíneo. En el caso de que no se disponga de suero para realizar esta prueba, se recomienda que otro técnico compruebe el resultado de la determinación celular.

Fundamento

El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes- Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.

Esta técnica puede realizarse tanto en porta como en tubo, aunque ser prefiere la determinación en tubo porque la centrifugación de los hematíes intensifica el fenómeno de aglutinación.

Material necesario

• Tubos de centrifuga.
• Pipetas Pasteur.
• Baño de agua.
• Centrifuga.
• Reloj.
• Rotulador de vidrio.
• Gradilla.

Reactivos

• Hematíes del grupo A1.
• Hematíes del grupo A2.
• Hematíes del grupo B.
• Hematíes del grupo 0.
• Hematíes de la sangre problema.

Muestra

• Suero obtenido mediante coagulación de la sangre en baño de agua a 37°C durante 20 a 30 minutos.

Posteriormente centrifugamos durante 10 minutos a 3.000 r.p.m y extraemos el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur.

Técnica

1. Para evitar falsos negativos por la presencia de complemento activo en el suero, es aconsejable la inactivación previa de la muestra. Esto se realiza manteniendo el suero en un baño de agua a 56°C durante 10 minutos. Con esto evitamos los fenómenos de hemólisis debidos al complemento.
2. Lavamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con solución salina isotónica según la técnica descrita en la práctica XVIII. Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5% en solución salina.
3. Rotulamos un tubo de centrífuga con la letra A1, otro con la letra A2, otro B, otro 0 y otro C.
4. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado.
5. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado. En el tubo C añadimos una gota de la suspensión de los hematíes propis de la sangre problema, ya que nos servirá de control negativo.
6. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1.000 r.p.m durante 1 minuto.

Lectura de resultados

Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático.

Si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro indica que existe aglutinación. En el caso contrario, los hematíes se resuspenden homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

El grupo eritrocitario que se asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el siguiente cuadro:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	Ac presentes en el suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti-B	A1
- o +*	-	+	-	-	Anti-B y anti-A1*	A2
+	+	-	-	-	Anti-A	B
+	+	+	-	-	Anti-A y anti-B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
- o +*	-	-	-	-	Ninguno o Anti-A1	A2B
+	+	+	+	+	Autoanticuerpos	Ininterpretable

+ = Aglutinación

˗ = No aglutinación

* = Este anti-A1 se encuentra sólo en un 2% de los individuos A2.

Ó = Este resultado se observa sólo en el 25% de los individuos A2B.

Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacidos, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aún. También encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia, ya que carecen de anticuerpos, y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecíficos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo AB0.

Discrepancias entre la prueba celular y la sérica

En el caso de no obtener el mismo resultado en ambas pruebas debemos proceder de la siguiente manera:

1. Repetir ambas pruebas.
2. En el caso de persistir la discrepancia, so obtendrá una nueva muestra de sangre y se realizarán ambas pruebas utilizando hematíes lavados y resuspendidos correctamente a la concentración óptima de cada técnica.
3. Efectuar una prueba de Coombs directo sobre los hematíes para detectar posibles Autoanticuerpos.
4. Realizar la prueba sérica utilizando un panel de screening con hematíes A1, A2, B, 0.

Causas del a discrepancia entre la prueba celular y sérica

Las causas más frecuentes obedecen a tres tipos distintos:

1. Errores técnicos:

• Identificación incorrecta de las muestras o anotación de los resultados.
• No añadir todos los reactivos y muestras correspondientes.
• Contaminación de los reactivos o hematíes del panel de screening.
• Proporción inadecuada de muestra y reactivos.
• Sobrecentrifugación o centrifugación insuficiente.
• No valorar la hemólisis considerándola como aglutinación negativa.

2. Problemas con la muestra:

• Presencia de Autoanticuerpos.
• Antígenos A o B débiles, congénitos o adquiridos.
• Especificidad B adquirida en pacientes A1 por una infección bacteriana.
• Inmunodeficiencias congénitas o adquiridas.
• Fenómenos de Rouleaux.

ACTIVIDADES.

1. ¿Que son los hematíes tipados ? son los que sabemos de que grupo son.
2. ¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente? al 5%
3. ¿Qué clase de muestra se emplea en esta técnica ? suero del paciente inactivado o plasma.
4. ¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación ? Que hemos cometido algún error.

Resultados obtenidos

	Aglutinación	No aglutinación
Tubo A1
Tubo A2	+
Tubo B
Tubo 0
Tubo C

Valoración de los resultados

• Los Ac encontrados en el suero son:

_ Anti-A2 _ Autoanticuerpos

• El grupo eritrocitario de la sangre analizada es:

 A

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO. 23/4/15

Fundamento

Los hematíes problema contienen las sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos.

El resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes.

Material necesario

• Tubos de centrífuga.
• Rotulador de vidrio.
• Pipetas Pasteur.
• Centrífuga.
• Gradillas.

Reactivos

• Suero anti-A.
• Suero anti-B.
• Suero anti-AB.
• Solución salina fisiológica.

Muestra

• Sangre total anticoagulada. Para esta técnica es preferible usar una suspensión de los hematíes problema.

Técnica

1. En primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello rotulamos convenientemente un tubo de centrífuga y añadimos 1 ml de la muestra de sangre. Completamos el tubo con solución salina y agitamos para suspender los hematíes. Centrifugamos 4 minutos a 2.000 r.p.m y decantamos el sobrenadante.
2. A los hematíes del tubo les añadimos una cantidad suficiente de solución salina como para obtener una suspensión al 2%. Esto es aproximado, aunque debemos establecer los límites entre el 2 y el 4%.
3. Rotular tres tubos de ensayo bien limpios con las letras A, B y AB.
4. Añadir a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2%.
5. Añadir dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B en el tubo B, y dos gotas de anti-AB en el tubo AB.
6. Centrifugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m o 30 segundos a 3.000 r.p.m (centrifuga de inmunohematología)

Lectura de resultados

Después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

Reacción negativa: Los hematíes se resuspenden homogéneamente.

Reacción positiva: Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Se realizan igual que en la técnica en porta.

Es importante destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en los tubos pueden ocasionar falsos negativos.

También pueden darse falsos positivos, principalmente por dos motivos:

• Aglutinación no específica: Se debe a la presencia de ácido hialurónico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, y se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes.
• Fenómeno de Rouleaux: Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que más frecuentemente originan este fenómeno son: el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.

Estos fenómenos pueden evitarse con el lavado previo de los hematíes problema.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ? La aglutinación.
2. ¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problema ? Al 2% o también se puede al 4 %.
3. ¿Cómo se ve una aglutinación positiva ? Se observa un botón de hematíes .
4. ¿A qué se debe el fenómeno de Rouleaux ?  al fibrinógeno, las gammaglobulinas ,el dextrano y la polivinilpirrolidona.
5. ¿Cómo pueden evitarse los falsos positivos ? Con el lavado previo de los hematíes problema 

Resultados obtenidos

Valoración de los resultados obtenidos

La sangre ensayada es del grupo eritrocitario:

 A

 DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA. 22/4/15

INTRODUCCIÓN

La detección celular del grupo ABO puede realizarse mediante una técnica en porta o en tubo.

En ambos casos, los hematíes problema, que contienen sustancias antigénicas (aglutinógenos) del sistema ABO, se enfrentan con antisueros (aglutininas) dirigidos contra esos antígenos.

El resultado final de esta determinación consiste en la aglutinación directa de los eritrocitos cuando reacción contra el antisuero que les corresponde.

Para estos estudios in vitro se utilizan anticuerpos anti-A, anti-B y anti-AB procedentes de donantes o que se obtienen mediante síntesis con hibridomas de linfocitos sensibilizados y células de mieloma múltiple (Ac monoclonales*). Sin embargo, como aglutininas anti-A1 o anti-H se utilizan lectinas.

Las lectinas o fitoaglutininas son proteínas presentes en algunas plantas, sobre todo en sus semillas, capaces de aglutinar a los hematíes humanos. Una de ellas, extraída de las semillas de la leguminosa Ulex europeaus, es capaz de aglutinar específicamente los hematíes que contienen sustancia H, y también es eficaz para detectar esta sustancia en la saliva, por lo que se utiliza para identificar a los individuos secretores. El extracto de la semilla de otra leguminosa, Dolichos biflorus, puede aglutinar a los hematíes A1 y A1B no aglutina a los hematíes A2, A2B B y O.

Es importante mencionar que todas estas determinaciones deben hacerse a temperatura ambiente, ya que la aplicación de calor puede afectar a los hematíes impidiendo observar una posible aglutinación.

Fundamento

Consiste en observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo ABO del individuo.

Material necesario

• Un portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco.
• Un rotulador de vidrio.
• Una pipeta pasteur desechable.
• Palillos mezcladores.
• Un reloj.

Reactivos

• Suero anti-A.
• Suero anti-B.

Muestra

• Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

Técnica

• Dividir un portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio. Marcar una con la letra A y otra con la letra B.
• Depositar una gota de suero anti-A (azul) en la sección A del portaobjetos, y una gota del suero anti-B (amarillo) en la sección B.
• Situar una pequeña gota de sangre (aproximadamente la mitad del volumen usado de antisuero) junto a la gota de antisuero.
• Mezclar ambas gotas en cada sección utilizando un palillo distinto en cada una de ellas y formando un círculo de 2 a 2,5 cm de diámetro.
• Hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia atrás, durante dos minutos.
• Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Lectura de resultados

Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro. En el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

La presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante examen microscópico de las mezclas.

En general estas pruebas son muy eficaces ya que la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacción y el tamaño de los grumos. El resultado puede observarse en unos segundos, aunque conviene reexaminar la reacción del anti-A al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil. Éstas suelen ocurrir en menos de un 1% de las muestras analizadas.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

El grupo eritrocitario que se le asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el cuadro siguiente:

Hematíes y suero anti-A	Hematíes y suero anti-B	Grupo eritrocitario
+	-	A
-	+	B
+	+	AB
-	-	0

+ = presencia de aglutinación

˗ = ausencia de aglutinación

En el caso de que el grupo obtenido sea el A, los hematíes problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina anti-A1: de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al subgrupo A1.

ACTIVIDADES.

1. ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis ? La aglutinación.
2. ¿Qué muestra utilizamos ? Sangre capilar.
3. ¿Cómo se ve la aglutinación positiva ?Grumos rojos que flotan sobre el líquido antisuero.
4. ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A? Reexaminar la reacción del anti -A1 al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil.

Resultados obtenidos

Valoración de los resultados

La sangre analizada es del grupo eritrocitario:

 A2