PRUEBA DE LA SACAROSA. 27/2/15

FUNDAMENTO

La prueba de la sacarosa consiste en situar los hematíes problema en un medio de baja fuerza iónica (por ejemplo, una solución de sacarosa). En este medio, los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que cuando los glóbulos rojos presentes en la muestra vienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento, tienden a sufrir la acción de éste y, por tanto a lisarse.

Material necesario

• Pipeta Pasteur.
• Pipetas graduadas ( 1 de 5 ml. 2 de 2 ml y 3 de 0,5 ml).
• Una pipeta automática capaz de dispensar 0,1 ml (100 µl).
• Puntas de pipeta automática.
• 6 tubos de centrífuga.
• Un reloj.
• Una centrífuga.
• Un espectrofotómetro.
• Cubetas de espectrofotómetro.
• Un rotulador de vidrio.
• Una gradilla.

Reactivos

• Solución acuosa de sacarosa (azúcar común) a una concentración del 9,24%.
• Sangre control. Ésta ha de ser normal y tiene que haber sido extraída recientemente.
• Solución acuosa de amoniaco a una concentración del 0,04%. Ésta puede prepararse, por ejemplo, de la siguiente forma:

• 0,2 ml de hidróxido amónico (NH40H) al 20%.
• 99,8 ml de agua destilada.

• Suero fisiológico (solución salina al 0,9%).

Muestra

• Sangre venosa, completa y anticoagulada con oxalato cálcico, EDTA o ACD (ácido cítrico-dextrosa).

Técnica

1. Rotular 3 tubos. Uno con las sigas SF ( de suero fisiológico), otro con las siglas SC ( de sangre control) y otro con las siglas SP ( de sangre problema).
2. Rellenar estos tubos según las indicaciones del cuadro siguiente:

	Tubo SF	Tubo SC	Tubo SP
Suero fisiológico (en ml)	1,8
Solución de sacarosa (en ml)		1,8	1,8
Sangre problema (en ml)	0,2		0,2

3. Agitar, suavemente, los tubos.
4. Dejar los tubos en reposo, a temperatura ambiente y durante 30 minutos.
5. Centrifugar los tubos a 2.000 rpm durante 5 minutos.

Lectura de resultados

La lectura de resultados puede ser visual o espectrofotométrica.

Visualmente se considera que no hay hemólisis cuando se observa un botón sedimentario rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. Sin embargo, se estima que hay hemólisis cuando se advierte la presencia de un líquido rojizo y transparente. En los tubos SF y SC no tiene que haber hemólisis, ya que estos tubos funcionan como controles negativos.

Para la lectura espectrofotométrica, se requiere la preparación de 3 tubos: tubo blanco (TB), tubo pratón (TPa) y tubo problema (TPr). La forma de preparar estos tubos se explica en el cuadro que se muestra a continuación:

	TB	TPr	TPs
Solución de amoniaco (en ml)	5	5	5
Suero fisiológico (en ml)	0,3
Sobrenadante del tubo SP (en ml)		0,3
Líquido resuspendido del tubo SF (en ml)			0,3

Tras preparar estos tubos, se recoge el líquido contenido en cada uno de ellos y se mide su absorbancia en un espectrofotómetro ajustado a 540nm.

En esta lectura espectrofotométrica se utiliza el líquido del tubo blanco para poner el aparato a 0 de A, y el líquido del tubo patrón se emplea para determinar la A que corresponde a un 100% de hemólisis.

Los resultados espectrofotométricos de esta prueba se ofrecen en forma de tanto por ciento de hemólisis. El cálculo del porcentaje de hemólisis que corresponde al tubo problema se realiza mediante la siguiente fórmula:

% de hemólisis = A / AM x 100

A = Absorbancia del líquido presente en el tubo problema.

AM = Absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón ( A máxima).