DETERMINACIÓN FUNCIONAL DEL FIBRINÓGENO. 9/3/15

INTRODUCCIÓN

El fibrinógeno plasmático puede ser cuantificado mediante diferentes métodos. Sin embargo, actualmente, sólo se suelen utilizar aquellos que exploran sus capacidades funcionales o antigénicas.

Fundamento

La determinación cronométrica de fibrinógeno, según el método de von Clauss, se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina de degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en formar un coágulo.

El tiempo que tarda en originarse el coágulo de fibrina depende, exclusivamente, de la cantidad inicial de fibrinógeno y es inversamente proporcional a la concentración de éste en el plasma estudiado (fibrinogenemia).

En estas condiciones, el logaritmo del tiempo de coagulación está en relación lineal con el logaritmo de la fibrinogenemia.

Material necesario

• Una gradilla.
• 8 tubos de ensayo de plástico.
• Una prepipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1ml (1.000 µl) y otra de 2ml (2.000 µl) de capacidad.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.
• 9 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl (las de color amarillo).
• Un rotulado de vidrio de punta fina.
• 7 cubetas de coagulómetro.
• 7 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un bolígrafo.
• Una hoja de papel de tipo logarítmico-logarítmico. También se puede utilizar un papel especial como, por ejemplo, el Fibri-Graph suministrado por los Laboratorios bioMérieux.

Reactivos

• Un Fibrinogène-Kit de los laboratorios bioMérieux. Este Kit contiene 2 reactivos.

-Reactivo 1: es trombina bovina a una concentración de 100 U NIH/ml.

Con esta concentración tal alta de trombina la prueba no se ve interferida por niveles terapéuticos de heparina; aunque sí puede ser falseada por niveles muy altos de PDF.

Cada vial de reactivo 1 contiene un liofilizado que debe ser reconstituido con 3 ml de agua destilada.

-Reactivo 2: es tampón veronal a pH 7,35.

Contiene también un anticoagulante y un antifibrinolítico.

Se utiliza para diluir el plasma calibrado y la muestra.

También se puede emplear la trombina bovina elaborada por cualquier otro laboratorio comercial (por ejemplo, la de Pacific Hemostasis) y un tampón imidazol.

• Un plasma calibrador o de referencia: es un plasma cuya concentración de fibrinógeno es conocida.

Como plasma calibrador se puede utilizar el Caliplasma preparado por los Laboratorios bioMérieux. Éste contiene fibrinógeno a una concentración que está indicada en el folleto que se adjunta con el reactivo.

• Agua destilada.

Muestra

• Un plasma pobre en plaquetas (PPP), correctamente preparado.

Técnica

1. Homogeneizar los reactivos, sin agitarlo bruscamente.
2. Diluir el plasma calibrador y la muestra, de la manera que se indica en el siguiente cuadro:

Plasma calibrado (en µl)	100	100	100	100	100	100	100
Muestra (en µl)	0	0	0	0	0	0	100
Tampón veronal (en µl)	400	900	1.400	1.900	2.400	2.900	900
Dilución	1/5	1/10	1/15	1/20	1/25	1/30	1/10
Fibrinogenemia	Cx2	C	C/1,5	C/2	C/2,5	C/3	¿

C = concentración del fibrinógeno en el plasma calibrador.

3. Depositar el volumen total de trombina bovina que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
4. Atemperar la trombina bovina a temperatura ambiente (20-25°C). Si se utiliza la trombina de los laboratorios torios Pacific Hemostasis, hay que atemperarla a 37°C.
5. Introducir un trocito de acero apropiado en 7 cubetas de coagulómetro.
6. Rotular el extremo superior de 6 cubetas con las concentraciones: Cx2, C, C/1,5, C/2, C/2,5 y C/3; y el de otra cubeta con la letra M (de Muestra).
7. Verter 200 µl de cada una de las diluciones del plasma calibrador y de la muestra en sus cubetas correspondientes.
8. Incubar las diluciones del plasma calibrador y la muestra, contenidas en las cubetas, a 37°C, durante 2 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
9. Colocar, sucesivamente, cada una de las cubetas en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 100 µl de trombina bovina.

Al agregar la trombina, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo trascurrido desde la adición de la trombina.

Lectura de resultados

Lo más correcto es determinar tres veces el tiempo en el que coagulan la muestra y las diluciones del plasma calibrador, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

Si el resultado final determinado en la muestra es menor que 7 segundos, la fibrinogenemia es muy alta, por lo que se ha de repetir la determinación, pero partiendo de una dilución de 1/20 (100 µl de muestra de tampón veronal), y el resultado nuevo se debe multiplicar por 2.

Sin embargo, si el resultado final determinado en la muestra es mayor que 40 segundos, la fibrinogenemia es muy baja, por lo que se ha de repetir la determinación, pero partiendo de una dilución de 1/5 (100 µl de muestra + 400 µl de tampón veronal), y el resultado nuevo se debe dividir entre 2.

Para establecer la fibrinogenemia de la muestra se ha de trazar, previamente, en papel bilogarítmico, una curva de referencia o de calibración. Para ello, se anotan en el eje de ordenadas (el vertical), los valores en segundos del tiempo en el que coagulan cada una de las diluciones del plasma calibrador, y en el eje de abscisas (el horizontal), las concentraciones de fibrinógeno que corresponden a cada una de ellas.

Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluye cada valor de tiempo de coagulación con su fibrinogenemia correspondiente. A continuación, se dibuja la recta que mejor une los 6 puntos.

Finalmente, el valor en segundos del tiempo de coagulación determinado en la muestra, se interpola en la curva de calibración, previamente preparada, y se halla la concentración de fibrinógeno que le corresponde a éste.

La fibrinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 mg/dl.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

La formación de fibrinógeno y, por tanto, su concentración plasmática puede estar disminuida por trastornos congénitos (afibrinogenemia congénita) o adquiridos (hepatopatías).

La fibrinogenemia asciende, de una forma inespecífica, en multitud de procesos inflamatorios, debido a que es un reactante de fase aguda.

ACTIVIDADES.

1. ¿De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica?
2. ¿A qué concentración está la trombina bovina? 100%
3. ¿A qué dilución se somete a la muestra? 1/10
4. ¿Cuál es la fibrinogenemia normal? ENTRE 150 Y 450 SEGUNDOS