ESTUDIO DE LA
FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS HEMATÍES. 27/2/15
FUNDAMENTO
El estudio de la fragilidad osmótica
de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a
soluciones de presión osmótica* decreciente, en condiciones
constantes de pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los
hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya
concentración es decreciente a partir de 9 gramos por ml (soluciones
hipotónicas*).
Cuando los eritrocitos están en
contacto con soluciones hipotónicas, penetran agua a través de su
membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de la
Hb, que contienen puede salir al exterior a través de los poros de
su membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se
rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis).
En condiciones normales, un eritrocito
puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su
volumen en un 70% como máxima.
Esta prueba evalúa por tanto la
capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de
su contenido acuoso ( resistencia osmótica eritrocitaria o ROE).
Dentro de una misma sangre, la ROE de
los hematíes varía de unos a otros.
Material necesario
- Pipeta Pasteur.
- Tubos de centrífuga iguales entre sí.
- Un reloj.
- Una centrífuga.
- Un espectrofotómetro.
- Cubetas de espectrofotómetro.
- Una gradilla.
Reactivos
- Suero fisiológico, preferiblemente, tamponado a pH fisiológico (7,4). Esta solución salina puede prepararse de la siguiente forma:
- 9 g de cloruro sódico (NaCI).
- 2,7 g de fosfato sódico di-básico (Na2HPO4.12H2O).
- 0,2 g de fosfato sódico mono-básico (NaH2PO4.2H2O).
- 1.000 ml de agua destilada.
- Agua destilada.
Muestra
- Sangre venos completa y adecuadamente anticoagulada.
Como
anticoagulante debe utilizarse la heparina, que otros
anticoagulantes, como el oxalato y el citrato, aportan unos iones
suplementarios al medio hipotónico, que pueden alterar la
concentración salina de éste.
No deben haber
pasado más de 2 horas desde la extracción de la sangre hasta su
utilización. En el caso de que la muestra se haya conservado a 4 ⁰
C, puede prolongarse este tiempo a 6 horas.
Técnica
- Preparar una batería de soluciones de cloruro sódico, a concentraciones decrecientes, de la forma que se indica a continuación:
|
Tubo n⁰ |
1
|
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
|
Agua destilada (gotas) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
|
Suero fisiológico taponado (gotas) |
18 |
17 |
16 |
15 |
14 |
13 |
12 |
11 |
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
|
Concentración obtenida (en gl) |
9 |
8,5 |
8 |
7,5 |
7 |
6,5 |
6 |
5,5 |
5 |
4,5 |
4 |
3,5 |
3 |
2,2 |
2 |
1,5 |
1 |
0,5 |
- Añadir a cada tubo 1 gota (0,5 ml = 50µl) de sangre completa.
Esto ha de
hacerse de forma que la gota llegue a la solución de cloruro sódico
sin que toque la pared interna del tubo.
Agitar suavemente los tubos.- Dejar los tubos en reposo, al menos 30 minutos, a temperatura ambiente (unos 25 ⁰ C).
- Centrifugar los tubos a 2.000 revoluciones por minuto (rpm), durante 5 minutos. En vez de centrifugar los tubos, también se pueden dejar simplemente en reposo, durante 3 horas.
Lectura de resultados
La lectura de resultados puede ser
visual o espectrofotométrica. En ambos casos, lo que se valora es la
presencia o la usencia de hemólisis en los tubos.
Si la lectura es visual, se considera
que no hay hemólisis cuando en el tubo se observa un sedimento en
forma de botón rojizo un líquido sobrenadante incoloro y
tranparente. Sin embargo, se estima que hay una hemólisis parcial
cuando se advierte la presencia de un botón sedimentario, pero que
se acompaña de un sobrenadante rojizo y transparente. Y finalmente,
se considera que la hemólisis es total cuando sólo se aprecia la
existencia de un líquido rojizo y transparente.
Si los eritrocitos presentes en el
botón sedimentario de cualquier tubo se resuspenden mediante
agitación, el sobrenadante se enturbiará.
Para realizar la lectura
espectrofotométrica, se recoge de forma separada el líquido
contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia (A) de cada
uno de ellos, en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de
onda (λ) de 540 nm.
El blanco utilizado en esta medicación
espectrofotométrica consiste en el líquido presente en el tubo n⁰
1, ya que al haber sido éste elaborado a partir de una solución de
cloruro sódico a una concentración de 9g/l, se supone que la
hemólisis debe haber sido nula y, por tanto, que la absorbancia
medida en él no ha de ser valorada.
Los resultados espectrofotométricos de
cada tubo se ofrecen en forma de porcentaje (%) de hemólisis. Para
ello, se considera que la A medida en el líquido procedente del tubo
n⁰ 18 corresponde a un 100% de hemólisis, que al haber sido
preparado con la solución más hipotónica, debe ser el más
hemolizado. Por tanto, el porcentaje de hemólisis que corresponde a
cada tubo se calcula con la siguiente fórmula:
% de hemólisis = A / AM x 100
A = Absorbancia del líquido presente
en el tubo analizado.
AM = Absorbancia del líquido contenido
en el tubo n⁰ 18 (A máxima).
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS
RESULTADOS OBTENIDOS
En condiciones normales, debe
apreciarse visualmente una hemólisis parcial clara a partir del tubo
n⁰ 10 (el preparado con solución salina a 4,5 g/l) y una hemólisis
prácticamente total a nivel de los tubos 12,13 o 14 (los que
contienen, respectivamente, solución salina a 3,5, 3 y 2,5 g/l).
Además, generalmente, el 50% de
hemólisis se produce a nivel de los tubos 10 u 11 (los que
contienen, respectivamente, solución salina a 4,5 y 4 g/l).
Cuando la ROE baja, aumenta la
hemólisis en los tubos que contienen solución salina a mayor
concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en la
eliptocitosis u ovalocitosis congénita y en la estomatocitosis
hereditaria, debido a que en estas enfermedades la superficie de los
hematíes está disminuida con respecto a su volumen, por lo que
éstos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su
fragilidad osmótica.
Cuando la ROE sube, la aparición de la
hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen
solución salina a una concentración menor que lo previsto. Esto
acontece con los reticulocitos y con los glóbulos rojos propios de
la talasemia minor y de la anemia ferropénica, debido a que estas
células tienen incrementada su superficie en relación con su
volumen, por lo que toleran mejor la entrada de agua y tienen
disminuida su fragilidad osmótica.
ACTIVIDADES
1º¿Qué concentración de Na Cl tiene el suero fisiológico ?
Está tamponado a pH (7,4).
2º¿En qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin qué estos se rompan ?
en una concentración de g/l :9 , 8,5 , 8 , 7,5 ,7 ,6,5 , 6 ,5,5 y 5 .
3º¿Qué sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba ?
cloruro sódico .
4ºEn esta prueba,¿cuál es la concentración salina menor a la qué se preparan las soluciones ?
9 .
5º En condiciones normales,¿a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50 % ?
a 4,5 y 4 g/l.
6º ¿En qué enfermedades se produce una disminución de la ROE ?
esferocitosis hereditaria ,eliptocitosis u uvalocitosis cóngenita y en la estomacitosis hereditaria
RESULTADOS OBTENIDOS :
Lectura visual :
- Primer tubo en el que se observa con claridad una hemólisis parcial : el 10.
Concentración de la solución salina contenida en este tubo : 4,5.
- Primer tubo en el que se aprecia una hemólisis prácticamente total :el 18.
Concentración de la solución salina presente en este tubo : 0,5
LECTURA ESPECTROFOTOMÉTRICA :
Tubo nº A %
___________________________________
3 0.651 67.70
5 0.774 73.36
8 0.958 90.80
10 1.008 95.54
14 1.080 102.36
16 0.978 92.70
18 1.055 100
- Concentración de la solución salina que da lugar a una hemólisis del 50%: 4.5
- La fragilidad osmótica de los hematíes en la sangre estudiada es:
- La ROE de la sangre analizada es:
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