ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS. 29/1/15

Fundamento.

La carga eléctrica global de las hemoglobinas es la resultante de la suma de las cargas de los aminoácidos que contribuyen las cadenas polipeptídicas de su globina.

En la electroforesis de hemoglobinas, el hemolizado se deposita sobre un soporte empapado en un líquido alcalino y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa.

Como las cadenas polipeptídicas de la globina en medio básico adquieren una carga eléctrica neta negativa, las hemoglobinas se van desplazando progresivamente hacia el ánodo (migración).

Pero en la sangre hay varios tipos de hemoglobinas y cada una de ellas adquiere la carga eléctrica de una forma más o menos intensa. Así pues, las más electronegativas avanzan más rápidamente hacia el ánodo y las menos electronegativas lo hacen más lentamente.

Al cabo de un cierto tiempo, las moléculas de Hb idénticas se agrupan entre sí y adoptan el aspecto de bandas.

Cada banda está constituida por un tipo diferente de Hb y se separa del resto debido a su distinta carga eléctrica neta y, por consiguiente, a su diferente capacidad de migración.

Material necesario

• Una gradilla.
• Tubos de centrifuga.
• Pipetas Pasteur.
• Pipetas graduadas de 0,5, 1, 2 y 5 ml
• Una centrífuga
• Un espectrofotómetro
• Cubetas de espectrofotómetro
• Un vidrio de reloj
• Bateas
• Pinzas
• Papel de filtro
• Probetas de 100 ml de capacidad
• Una placa de vidrio de unos 18 x 18 cm
• Una estufa
• Un reloj
• Una fuente de alimentación
• Una cubeta: es el recipiente donde se lleva a cabo la electroforesis.

• Un puente: en él se sitúan las tiras soporte para que estén horizontales y con sus extremos en contacto con un tampón.

• Un aplicador: se utiliza para depositar la muestra sobre las tiras soporte.

• Medio de soporte: es el medio físico en el cual migran las proteínas.

Reactivos

• Suero fisiológico (solución de cloruro sódico al 0,9%).
• Agua destilada o desionizada.
• Cloroformo o triclorometano (CI3CH).
• Tampón: es el líquido que ioniza las proteínas.

En esta práctica se utiliza un tampón TRIS-GLICOCOLA, cuya composición es la siguiente:

Tris-Hidroximetilaminometano. . . . . . . . . 7,05 g.

Glicocola. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11,3 g.

Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c.s.p 1000 ml.

• Colorante: se emplea para poner de manifiesto las bandas que se han formado tras la migración electroforética.

Aunque las bandas pueden teñirse con varias sustancias, en esta práctica se recomienda el uso del rojo Ponceau, cuya composición es la siguiente:

Rojo Ponceau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g.

Ácido tricloroacético al 5% . . . . . . . . . . . 100 ml

• Decolorante: elimina el exceso de colorante que tiñe las tiras.

Su composición depende del colorante empleado.

Si se utiliza como colorante el rojo Ponceau, el decolorante es una solución acuosa de ácido acético al 5%.

• Deshidratante: alcohol metílico (metanol).
• Solución trasparentadora: se prepara mezclado, extreporáneamente*, una solución A y otra B, a una proporción de 9 partes de A con una parte de B.

La composición de las dos soluciones transparentadoras es la siguiente:

Solución A:

Metanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 870 ml.

Ciclohexanona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 ml.

Solución B:

Ácido acético. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100ml.

El tampón, el colorante y las soluciones tranparentadoras puedes ser suministrados, ya preparados, por laboratorios comerciales (por ejemplo, por los laboratorios ATOM).

Muestra

• Hemolizado preparado de la siguiente manera:

1. Anticoagular la sangre problema.
2. Centrifugar la sangre anticoagulada a 3.000 rpm, durante 5 minutos.
3. Retirar el plasma.
4. Resuspender los hematíes con 4-5 ml de suero fisiológico.
5. Centrifugar la suspensión de hematíes a 3.000 rpm durante 5 minutos.
6. Retirar el sobrenadante.
7. Repetir el lavado de los hematíes 3 veces más hasta obtener un concentrado de hematíes lavados.
8. Hemolizar los hematíes, añadiendo, a 1 volumen de éstos, 1,5 volúmenes de agua destilada y 0,5 volúmenes de cloroformo.
9. Agitar fuertemente la mezcla anterior.
10. Centrifugar la mezcla a 3.000 rpm, durante 20 minutos.
11. Retirar el hemolizado (el sobrenadante).
12. Determinar la concentración de Hb que está presente en el hemolizado, mediante un método habitual (por ejemplo, el de la cianmetahemoglobina).
13. Diluir el hemolizado con agua destilada hasta lograr que tenga una concentración de Hb de 5g/100ml.

Técnica

1. Sumergir las tiras en tampón durante 10 minutos como mínimo.
2. Absorber el exceso de tampón de las tiras, situándolas entre dos hojas de papel filtro.
3. Montar las tiras sobre el puente, de forma que quedan dispuestas con su casa absorbente (mate) hacia arriba. Para estar seguros de esto, la esquina cortada de las tiras siempre debe estar cercana al analista y hacia su lado derecho.
4. Verter en el interior de la cubeta la cantidad de tampón suficiente para que los electrodos queden cubiertos.
5. Introducir el puente con las tiras, en el interior de la cubeta, de forma que los extremos de éstas queden sumergidos en el tampón.
6. Depositar un poco de la dilución del hemolizado en el interior de un vidrio de reloj y tocarla, suavemente, con el extremo ranurado del aplicador para cargarlo con ella.
7. Situar la dilución del hemolizado, mediante el aplicador previamente cargado, sobre el extremo catódico de cada una de las tiras y, aproximadamente, a 1,5 cm de su borde libre.

Se considera extremo catódico de la tira al extremo de esta que está más cercano al cátodo. Este electrodo suele corresponderse con la entrada negra de la cubeta.

8. Conectar la cubeta al alimentador, usando un cable negro para la entrada de la cubeta y la salida del alimentador de color negro, y otro rojo para la salida de la cubeta y la entrada del alimentador de color rojo.

De esta manera se hace atravesar la corriente eléctrica desde el extremo catódico de las tiras hasta su extremo anódico.

9. Encender la fuente de alimentación y aplicar sobre las tiras una corriente eléctrica de 200 voltios, durante 90 minutos.
10. Transcurrido ese tiempo, apagar el alimentador y desconectarlo de la cubeta.
11. Sumergir las tiras, con su cara absorbente hacia abajo, en el colorante elegido, durante unos 10 minutos.
12. Decolorar las tiras, mediante baños sucesivos de las mismas en el decolorante apropiado, hasta que se vean claramente las bandas de hemoglobina y el fondo sea blanco.

Lectura de resultados

Para la lectura de las bandas presentes en las tiras, se suele proceder al trasparentado de las mismas. Esto se realiza de la siguiente manera:

1. Deshidratar las tiras, sumergiéndolas en metanol durante 1 minuto.
2. Sumergir las tiras en una mezcla de soluciones transparentadoras preparada recientemente.

Este baño de las tiras en la mezcla trasparentadora se efectúa bajo agitación y durante 1 ó 2 minutos.

3. Extender las tiras sobre una placa de vidrio, de forma que su cara absorbente quede en contacto con el cristal y procurando que no se formen burbujas de aire al hacerlo.

Si a pesar de ello se forman burbujas, se ha de intentar eliminarlas utilizando un tubo como rodillo.

4. Calentar la placa en una estufa, a una temperatura de 60-70 ⁰C, hasta que la transparencia de las tiras sea completa.
5. Dejar enfriar la placa, a temperatura ambiente, durante unos minutos.
6. Desprender las tiras de la placa.

Los resultados de la prueba pueden apreciarse visualmente o fotodesitométricamente.

La observación visual de las tiras transparentadas permite detectar la presencia de bandas anómalas, o de alteraciones (ausencia, adelgazamiento o engrosamiento) en las bandas normales.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos

La electroforesis de hemoglobinas permite detectar anomalías hemoglobínicas cuantitativas o cualitativas.

Las anomalías cuantitativas de la hemoglobina se deben al aumento y/o a la disminución de un tipo normal de Hb con respecto al resto. Esto sucede, por ejemplo, en la β talasemia.

Las anomalías cualitativas de la hemoglobina (hemoglobinosis) se deben a pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos que componen las cadenas de globina de algunas moléculas de Hb. Estos cambios modifican la carga eléctrica de estas moléculas de Hb y determinan una variación en su capacidad de migración. Las hemoglobinosis se detectan, por tanto, en la electroforesis, debido a la aparición de bandas de hemoglobinas anormales. Éste es el caso de la anemia falciforme y el de la hemoglobinosis C.

ACTIVIDADES

1. ¿De qué material son las tiras empleadas en esta técnica? CELLOGEL
2. ¿Cuál es el decolorante del rojo Ponceau? SOLUCION ACUOSA, ACIDO ACETICO 5%
3. ¿Cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable? FOTODENSITOMETRO
4. ¿En qué enfermedad aparece una banda electroforética de Hb S? ANEMIA FALSIFORME HOMOCIGOTICA.
5. ¿Cuál es la Hb normal más electronegativa? HEMOGLOBINA A.

Resultados obtenidos

Dibuje y nombre las bandas obtenidas