PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA. 6/3/15

INTRODUCCIÓN

Los resultados de una determinación del tiempo de protombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (Índice de Quick).

Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos de TP determinado en el plasma problema.

Fundamento

Para construir una curva de actividad de la protombina se prepara una batería de diluciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normal no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.

Tras ello, se asigna el 100% de actividad al número de segundos medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.

Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protombina), anotando, en el eje de ordenadas (el vertical), los valores, en segundos, del TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones y, en el eje de abscisas (el horizontal), el % de actividad asignado a casa uno de ellos.

Material necesario

• 8 tubos de ensayo de plástico.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una prepipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1.000 µl) de capacidad de dispensión.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl.
• 7 puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 µl (las de color amarillo).
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37°C.
• Un bolígrafo.
• Una regla.
• Una hoja de papel milimetrado. También se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
• Una gradilla.

Reactivos

• Solución salina al 0,85% o, mejor aún, tampón de Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:

Dietil-barbiturato de sodio………………………2,94 g

Acetato de sodio…………………………………….. 1,94 g

Agua destilada c.s.p………………………………….100 ml

• Una tromboplastina cálcica.
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal.

A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85% o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	½	1/3	¼	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asignado a cada dilución.

Técnica

1. Homogeneizar la tromboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
2. Depositar el volumen total del tromboplastina cálcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37°C. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37°C, entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50. El de otra con el de 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
6. Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
7. Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37°C, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar, sucesivamente, cada una de las 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

Cuando se forma el coágulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de resultados

El TP es el tiempo trascurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y de cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

Para construir la curva de actividad de la protombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas o de las y (el vertical), los valores, en segundo, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones y, en el eje de abscisas o de las x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.

ACTIVIDADES.

1. ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal? CON SUERO SALINO.
2. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de ½? 50
3. ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro? CUANDO SE LE AÑADE TROOMBOPLASTINA CALCICA.
4. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas? LOS VALORES EN SEGUNDOS.

Resultados obtenidos

	Tiempo de Protombina (TP)
Plasma control no diluido (de 100% de actividad)	26,5 SEGUNDOS
Plasma control diluido a ½ (de 50% de actividad)	22,1 SEGUNDOS
Plasma control diluido a 1/3 (de 33% de actividad)	0,5 SEGUNDOS
Plasma control diluido a ¼ (de 25% de actividad)	26,3 SEGUNDOS
Plasma de control diluido a 1/10 (de 10% de actividad)	76,4 SEGUNDOS